Vsaka celica v človeškem telesu vsebuje v osnovi enaka genska navodila, vendar se srčna celica vede povsem drugače kot živčna ali kožna celica. Dolga leta so znanstveniki domnevali, da je identiteta celice, ko ta enkrat pridobi specializirano vlogo, večinoma nespremenljiva. Danes lahko raziskovalci vzamejo zrelo celico odraslega človeka in jo vrnejo v prilagodljivo stanje, podobno matični celici. Nato jo lahko usmerijo v razvoj v srčno celico, nevron, jetrno celico ali drugo specializirano celico, potrebno za raziskave.
Na svojem predavanju v okviru poletnega tečaja BEST Ljubljana je dr. Darja Marolt Presen iz CTGCT predstavila znanstvene temelje te tehnologije ter pojasnila, kako spreminja raziskovanje bolezni, razvoj zdravil in regenerativno medicino. Predstavila je tudi praktične izzive pri preoblikovanju obetavne laboratorijske tehnike v varno, standardizirano in dostopno zdravljenje.
Ključni pojmi za razumevanje tehnologije iPSC
- Specializirana celica: Celica, prilagojena za opravljanje določene funkcije. Celice srčne mišice se na primer krčijo, nevroni prenašajo signale, kožne celice pa tvorijo zaščitno plast.
- Matična celica: Celica, ki se lahko samoobnavlja in tvori celice z bolj specializiranimi funkcijami. Matične celice sodelujejo pri razvoju, vzdrževanju tkiv in nadomeščanju poškodovanih celic.
- Potentnost celice: Opisuje obseg različnih specializiranih celic, ki jih lahko tvori matična celica. Nekatere matične celice lahko ustvarijo le eno ali nekaj sorodnih vrst celic, druge pa imajo bistveno širši razvojni potencial.
- Pluripotentna matična celica: Zelo prilagodljiva matična celica, ki se lahko razvije v katero koli vrsto celice v človeškem telesu, vključno s srčnimi, živčnimi, kostnimi in jetrnimi celicami.
- Embrionalna matična celica: Pluripotentna matična celica, prvotno pridobljena iz zarodka v zgodnji razvojni fazi. Te celice so znanstveno zelo dragocene, vendar njihov izvor odpira etična vprašanja in vpliva na možnosti njihove uporabe.
- Inducirana pluripotentna matična celica oziroma iPSC: Zrela odrasla celica, ki je bila biološko reprogramirana v pluripotentno stanje. »Inducirana« v tem primeru pomeni, da znanstveniki to stanje ustvarijo v laboratoriju, »pluripotentna« pa se nanaša na sposobnost celice, da se razvije v katero koli vrsto celice v telesu.
- Reprogramiranje: Proces ponastavitve bioloških navodil, ki ohranjajo specializirano identiteto celice. Reprogramiranje običajno ne spremeni osnovnega zaporedja DNK celice. Spremeni pa, kateri geni so aktivni.
- Diferenciacija: Proces usmerjanja matične celice proti specializirani identiteti, na primer v nevron, celico srčne mišice ali celico, ki tvori kost.
- Organoid: Majhna tridimenzionalna tkivna struktura, vzgojena iz celic v laboratoriju. Organoid posnema izbrane značilnosti pravega organa, zato je informativnejši od preproste ravne plasti celic. Tipičen primer je možganski organoid.
- Avtologne in alogenske celice: Avtologne celice izvirajo iz osebe, ki jih bo morda pozneje tudi prejela, medtem ko alogenske celice prihajajo od drugega darovalca. Ta razlika vpliva na imunsko združljivost, stroške proizvodnje in število bolnikov, ki bi jim bilo zdravljenje lahko na voljo.
Kako lahko odraslo celico vrnemo v prilagodljivo stanje?
Razvoj induciranih pluripotentnih matičnih celic je temeljil na pomembnem odkritju. Specializirana odrasla celica še vedno vsebuje vse genske informacije, potrebne za nastanek drugih vrst celic. Kožna celica na primer uporablja predvsem navodila, potrebna za delovanje kože, vendar še vedno vsebuje širši nabor genskih navodil, prisotnih v celotnem telesu. Raziskovalci so odkrili, da lahko zrelo, specializirano celico ponastavijo z uvedbo le majhnega števila bioloških regulatorjev, imenovanih dejavniki reprogramiranja, ki se sicer izražajo v zgodnjem zarodku. V prvih poskusih so za reprogramiranje kožnih celic uporabili štiri dejavnike, imenovane OCT3/4, SOX2, KLF4 in c-MYC. Ti dejavniki so skupaj spremenili, kateri geni so bili aktivni, ponastavili razvojno pot celice in zrele celice vrnili v stanje, podobno embrionalnim matičnim celicam.
Prvi splošno priznani poskusi so bili uspešni na mišjih celicah leta 2006, leto pozneje, leta 2007, pa tudi na človeških celicah. To je pomenilo velik znanstveni preboj, saj je omogočilo nov vir pluripotentnih celic za katerega koli bolnika ali raziskavo brez uporabe človeških zarodkov. Odkritje je bilo leta 2012 nagrajeno z Nobelovo nagrado za fiziologijo ali medicino, le šest let po prvotnem odkritju.
Proces se lahko začne z razmeroma dostopnim vzorcem bolnika, na primer s krvjo ali kožo. Raziskovalci najprej izolirajo zrele celice in jih reprogramirajo v iPSC. Nato te celice gojijo v laboratoriju in jih izpostavijo skrbno izbranim signalom, ki spodbujajo njihov razvoj v vrsto celice, potrebno za določeno raziskavo.
To pomeni, da raziskovalcem ni vedno treba odvzeti vzorca neposredno iz poškodovanega ali težko dostopnega organa. Odvzem celic srčne mišice ali nevronov bolniku zgolj za raziskovalne namene bi bil težaven in potencialno nevaren. Namesto tega lahko znanstveniki odvzamejo dostopnejšo celico, jo reprogramirajo in iz nje v laboratoriju ustvarijo srčne ali živčne celice.
Ustvarjanje bolniku prilagojenih modelov bolezni
Ena najdragocenejših uporab iPSC je ustvarjanje celičnih modelov, ki ohranjajo bolnikovo gensko ozadje. Če ima oseba gensko bolezen, celice, pridobljene od te osebe, običajno vsebujejo gensko različico, povezano z boleznijo. Po reprogramiranju nastale iPSC to različico ohranijo in jih je mogoče pretvoriti v vrsto celice, ki jo bolezen prizadene.
Raziskovalci lahko na primer iz celic osebe z dedno motnjo srčnega ritma ustvarijo utripajoče celice srčne mišice. Te laboratorijsko vzgojene celice lahko reproducirajo spremembe električne aktivnosti, povezane z boleznijo. Znanstveniki lahko nenormalno delovanje neposredno opazujejo in preverijo, ali ga morebitno zdravljenje izboljša.
Takšen pristop je še posebej pomemben pri redkih boleznih. Posamezne redke bolezni prizadenejo razmeroma majhno število ljudi, zato je pogosto težko zbrati dovolj kliničnih podatkov ali bioloških vzorcev za klasične raziskave. Skupaj pa redke bolezni prizadenejo pomemben del prebivalstva ter predstavljajo velik izziv za bolnike, njihove družine, zdravstvene sisteme in razvijalce zdravil.
iPSC, pridobljene iz bolnikovih celic, lahko raziskovalcem pomagajo raziskovati, zakaj določena genska sprememba povzroča bolezen, tudi kadar neposreden dostop do prizadetega tkiva ni mogoč. Razkrijejo lahko tudi, ali se ljudje, pri katerih se navzven kaže enaka bolezen, na celični ravni odzivajo različno.
Tehnologije urejanja genoma lahko takšne poskuse še dodatno izboljšajo. Raziskovalci lahko v bolnikovih celicah popravijo domnevno bolezensko gensko različico in popravljene celice primerjajo z izvirnimi. Lahko pa isto različico vnesejo v zdravo celično linijo. Če nenormalno celično delovanje po popravku izgine ali se pojavi po vnosu različice, postanejo dokazi o povezavi med gensko spremembo in boleznijo močnejši.
Takšne primerjave lahko pomagajo tudi pri iskanju zdravljenja. Namesto preizkušanja zdravil na nepovezanih celicah lahko raziskovalci ocenijo, ali kandidatno zdravilo odpravi določeno težavo, povezano z boleznijo, v celicah z bolnikovim genskim ozadjem. To ne nadomešča kliničnih preskušanj, lahko pa pomaga prepoznati najbolj obetavne načine zdravljenja, še preden se začnejo raziskave na bolnikih.
Od utripajočih srčnih celic do miniaturnih modelov možganov
Inducirane pluripotentne matične celice je mogoče uporabiti za ustvarjanje številnih vrst specializiranih človeških celic. Celice srčne mišice so eden najbolj nazornih primerov, saj se lahko ob ustreznih laboratorijskih pogojih vidno krčijo. Raziskovalci lahko merijo njihov ritem, električno aktivnost, zgradbo in odziv na zdravila.
Te celice bi lahko izboljšale tako raziskovanje bolezni kot preverjanje varnosti zdravil. Nekatera zdravila nenamerno vplivajo na električni sistem srca in lahko povzročijo nevarne motnje srčnega ritma. Preizkušanje spojin na človeških srčnih celicah, pridobljenih iz iPSC, bi lahko pomagalo takšna tveganja odkriti že zgodaj v razvoju zdravil.
Enako načelo je mogoče uporabiti pri jetrih in živčevju. Jetra presnavljajo številna zdravila, zato je jetrna toksičnost pomembna skrb pri razvoju zdravil. Nevroni in druge možganske celice so ključne za raziskovanje nevroloških in nevrorazvojnih bolezni, vendar je živo človeško možgansko tkivo za raziskave le redko na voljo.
Znanstveniki lahko iPSC uporabijo tudi za razvoj organoidov. Možganski organoid ni miniaturni, popolnoma delujoči možgani. Gre za laboratorijsko vzgojeno strukturo, ki vsebuje živčne celice, razporejene tako, da posnemajo izbrane značilnosti zgodnjega razvoja možganov. Takšna organizacija lahko razkrije interakcije, ki jih je v ravni plasti celic težko opazovati.
Ko raziskovalci ustvarijo možganske organoide iz celic ljudi z genskimi boleznimi, lahko ti organoidi posnemajo nekatere značilnosti bolezni. Znanstveniki lahko nato raziskujejo, kdaj se pojavijo prve nepravilnosti, katere vrste celic so prizadete in ali eksperimentalni poseg spremeni razvojni proces.
Takšni modeli iz človeških celic pomagajo reševati trajen problem biomedicinskih raziskav: laboratorijske živali in običajne celične kulture ne morejo posnemati vseh vidikov človeške biologije. Raziskave na živalih ostajajo pomembne, vendar zdravljenje, ki deluje pri živalih, pri ljudeh morda ne bo imelo enakega učinka. Človeške celice, pridobljene iz iPSC, lahko ponudijo dodatno raven dokazov in raziskovalcem potencialno pomagajo sprejemati boljše odločitve o tem, katera zdravljenja naj napredujejo v klinična preskušanja.
Ali lahko te celice uporabimo za obnovo poškodovanih tkiv?
Pri modeliranju bolezni in preizkušanju zdravil celice preučujemo v laboratoriju. Regenerativna medicina gre še korak dlje in se sprašuje, ali bi lahko laboratorijsko proizvedene celice nadomestile tiste, ki so bile izgubljene zaradi poškodb, staranja ali bolezni.
V delu, predstavljenem na predavanju, so pluripotentne matične celice usmerili v razvoj v celice, ki tvorijo kost. Te celice so namestili na tridimenzionalna ogrodja, ki so jim zagotavljala fizično oporo in jim pomagala pri organizaciji v tkivu podobne strukture. Nato so z bioreaktorji nadzorovali posamezne vidike okolja celic, kot sta dovajanje hranil in mehanska stimulacija.
Ta kombinacija biologije matičnih celic, inženirstva in znanosti o materialih kaže na možnost proizvodnje tkiv za obnovo poškodovanih delov telesa. Drug pristop ponuja tridimenzionalno biotiskanje. Celice se lahko zmešajo s podpornim biomaterialom, ki ga včasih imenujemo biočrnilo, nato pa se plast za plastjo nalagajo v načrtovano strukturo.
Vendar je izdelava majhnega kosa razmeroma preprostega tkiva nekaj povsem drugega kot izdelava celotnega organa. Organi vsebujejo več vrst celic, razporejenih z izjemno natančnostjo. Potrebujejo tudi krvne žile, ki dovajajo kisik in hranila ter odstranjujejo odpadne snovi.
Brez učinkovitega oskrbovalnega omrežja celice globoko v večjem umetno ustvarjenem tkivu ne morejo preživeti. Ustvarjanje stabilnih struktur, podobnih žilam, in njihova povezava z bolnikovim krvnim obtokom zato predstavljata enega osrednjih izzivov tkivnega inženirstva.
Dodatna ovira je količina. Laboratorijski poskus lahko uporablja razmeroma majhno število celic, medtem ko bi zdravljenje lahko zahtevalo milijone ali milijarde celic. Raziskovalci morajo najti načine, kako celice proizvajati v velikem obsegu, ne da bi pri tem spremenili njihovo identiteto, funkcijo ali gensko stabilnost.
Močne celice zahtevajo strog nadzor varnosti
Prilagodljivost iPSC je hkrati njihova največja prednost in eno glavnih tveganj. Pred presaditvijo je treba celice diferencirati v predvideno terapevtsko vrsto celic. Če v končnem izdelku ostanejo nediferencirane pluripotentne celice, lahko nadaljujejo z rastjo ali ustvarijo več neustreznih vrst tkiv. V eksperimentalnih pogojih lahko takšne celice tvorijo tvorbe, imenovane teratomi.
Potencialno zdravljenje mora zato vsebovati pravilne celice in čim manj neželenih celic. Raziskovalci morajo dokazati tudi, da celice opravljajo predvideno funkcijo in med proizvodnjo ostajajo stabilne.
Nadzor kakovosti se začne že pri izvorni liniji iPSC. Znanstveniki preverjajo, ali celice kažejo pričakovane lastnosti pluripotentnosti in ali se lahko zanesljivo razvijejo v različne specializirane vrste celic. Prav tako preverjajo morebitne genske nepravilnosti.
Celična kultura je lahko na videz zdrava, hkrati pa vsebuje spremembe kromosomov, posameznih genov ali mitohondrijev, ki celicam zagotavljajo energijo. Takšne spremembe lahko nastanejo zaradi ponavljajočega se deljenja celic ali zaradi prenatrpanosti, oksidativnega stresa, dolgotrajnega gojenja ali neustreznih laboratorijskih pogojev. Sam vizualni pregled zato ni dovolj.
Zaradi varnostnih pomislekov so se spreminjale tudi metode reprogramiranja. Nekatere zgodnje tehnike so uporabljale viruse, ki so genski material vstavili v DNK celice. Čeprav so bile učinkovite, je takšna integracija lahko povzročila trajne in potencialno neželene spremembe. Raziskovalci so zato razvili neintegracijske metode z uporabo modificirane RNK, proteinov in drugih začasnih sistemov.
Tudi laboratorijski materiali postajajo vse bolj standardizirani. Slabo opredeljene sestavine živalskega izvora lahko povzročijo biološko variabilnost ali tveganje za kontaminacijo. Njihova zamenjava z natančno opredeljenimi ali s človekom združljivimi materiali lahko izboljša ponovljivost rezultatov in primernost postopka za klinično proizvodnjo.
Od raziskovalne metode do dostopnega zdravljenja
Proizvajanje celic za raziskave ni enako proizvodnji medicinskega izdelka. Klinično celično zdravljenje mora biti dosledno med posameznimi proizvodnimi serijami, njegovo identiteto, čistost, biološko aktivnost in varnost pa morajo podpirati ustrezni dokazi.
Proizvodnja mora potekati v nadzorovanih pogojih, z validirano opremo, dokumentiranimi postopki, usposobljenim osebjem in sledljivimi materiali. Te zahteve običajno označujemo kot dobro proizvodno prakso oziroma GMP. Zagotavljajo, da je zdravljenje, proizvedeno za eno skupino bolnikov, izdelano po enakih standardih kot zdravljenje za drugo skupino.
Izbira med bolniku prilagojenimi celicami in celicami darovalca ima tudi praktične posledice. Zdravljenje, izdelano iz bolnikovih lastnih celic, lahko zmanjša nekatere težave z imunsko združljivostjo, vendar je individualizirana proizvodnja lahko počasna, zapletena in draga, kot smo spoznali tudi v predavanju dr. Tine Fink o CAR-T. Standardizirana banka celic iz izbranih darovalcev bi lahko omogočila izdelavo zdravil za večje skupine bolnikov, vendar bi bilo v tem primeru tveganje za imunsko zavrnitev lahko večje.
Poleg znanstvenega napredka je treba upoštevati tudi stroške in dostopnost. Visoko individualizirane terapije so lahko tehnično izvedljive, ne da bi bile hkrati cenovno vzdržne za zdravstvene sisteme ali široko dostopne bolnikom. Naložbe v skupno proizvodno infrastrukturo, skupne standarde kakovosti, regulatorno strokovno znanje in mednarodno sodelovanje bodo ključne, če želimo, da zdravljenje na osnovi iPSC preseže okvir specializiranih centrov.
V bližnji prihodnosti bo največji vpliv iPSC verjetno izhajal iz njihove uporabe kot raziskovalnega orodja. Izboljšajo lahko razumevanje redkih in kompleksnih bolezni, pomagajo pri izbiri varnejših zdravil ter raziskovalcem omogočajo razvoj natančnejših genskih in celičnih terapij. Hkrati skrbno nadzorovane klinične raziskave še naprej preverjajo, ali lahko celice, pridobljene iz iPSC, pri bolnikih varno nadomestijo poškodovane celice.
Zaključek
Inducirane pluripotentne matične celice izvirajo iz običajnih zrelih celic, na primer celic iz krvi ali kože. Znanstveniki te celice ponastavijo v prilagodljivo stanje in jih nato usmerijo v razvoj v specializirane celice, potrebne za raziskave ali potencialno zdravljenje. Tako je mogoče človeške bolezni preučevati v ustreznih vrstah celic, raziskovati učinke genskih različic, preizkušati zdravila in razvijati nove načine za obnovo poškodovanih tkiv.
Tehnologija hkrati zahteva izjemno previdnost. Raziskovalci morajo nadzorovati, v kaj se celice razvijejo, zaznavati genske spremembe, odstraniti neželene celice, dosledno proizvajati velike količine celic in dokazati dolgoročno varnost. Znanstvene inovacije morajo spremljati ustrezna regulativa, trajnostna proizvodnja in politike, ki podpirajo pravičen dostop.
CTGCT se zahvaljuje dr. Darji Marolt Presen za jasno in celovito predstavitev tega, kako tehnologija iPSC povezuje temeljno celično biologijo z modeliranjem bolezni, razvojem zdravil, tkivnim inženirstvom ter praktičnimi vidiki razvoja varnih terapij.