Genska terapija se lahko začne z elegantno idejo: dostaviti genetsko navodilo v ustrezne celice in spremeniti njihovo delovanje. Toda med to idejo in dejanskim zdravljenjem stoji izjemno zahteven proizvodni proces. Dostavni sistem morajo proizvesti žive celice, nato ga je treba ločiti od bioloških nečistoč, preveriti njegovo kakovost in zagotoviti dosledno proizvodnjo. Že majhna razlika v kislosti, temperaturi, surovinah ali načinu vzorčenja lahko vpliva na končni izdelek.

Na predavanju, ki smo ga v okviru poletne delavnice CTGCT organizirali v sodelovanju z organizacijo BEST Ljubljana, je Jort Altenburg iz Centra za inovacije na področju naprednih terapij pri UMC Utrecht predstavil proizvodnjo virusnih vektorjev s posebnim poudarkom na začetnih proizvodnih procesih (upstream processing) ter postopkih pridobivanja in čiščenja produkta (downstream processing). Pojasnil je, zakaj proizvodnja virusnih vektorjev še vedno predstavlja ozko grlo pri razvoju številnih genskih in celičnih terapij ter kako morajo inženirstvo, avtomatizacija, nadzor kakovosti, regulativa, intelektualna lastnina in ekonomsko načrtovanje delovati usklajeno, da lahko obetavni laboratorijski rezultati prerastejo v zdravljenje bolnikov.

Ključni pojmi za razumevanje proizvodnje virusnih vektorjev

• Virusni vektor: Spremenjen virus, ki se uporablja za dostavo genetskega materiala v celico. Zasnovan je tako, da opravlja koristno dostavno funkcijo, ne da bi povzročal bolezen, povezano z izvornim virusom.
• Dostava genov in vivo: Pristop k zdravljenju, pri katerem se dostavni sistem, na primer virusni vektor, vnese neposredno v bolnikovo telo, da doseže tarčne celice.
• Gensko spreminjanje celic ex vivo: Postopek, pri katerem celice odvzamemo bolniku ali darovalcu, jih v nadzorovanem okolju gensko spremenimo in nato apliciramo bolniku.
• Začetni proizvodni procesi (upstream processing): Del proizvodnje, v katerem se žive celice odmrznejo, namnožijo, gojijo in spodbudijo k proizvodnji želenega biološkega produkta.
• Pridobivanje in čiščenje produkta (downstream processing): Postopki pridobivanja in čiščenja produkta po končani proizvodnji. Vključujejo lahko odstranjevanje celičnih ostankov, filtracijo, kromatografijo, koncentriranje in formulacijo.
• Bioreaktor: Nadzorovana posoda za gojenje celic ali mikroorganizmov, ki omogoča natančnejše spremljanje in prilagajanje okoljskih pogojev, kot je običajno mogoče v laboratorijskih gojitvenih posodah.
• Adherentne in suspenzijske celice: Adherentne celice za rast potrebujejo površino, na katero se pritrdijo, medtem ko suspenzijske celice prosto rastejo v tekočem mediju. Ta razlika vpliva na opremo, potrebo po delu, tveganje za kontaminacijo in možnosti povečanja obsega proizvodnje.
• Prehodna transfekcija: Proizvodna metoda, pri kateri se v proizvodne celice začasno vnesejo genetska navodila, pogosto z več plazmidi. Celice nato ta navodila uporabijo za sestavljanje delcev virusnih vektorjev.
• Proizvodna celična linija: Celična linija, ki je gensko spremenjena tako, da vsebuje del ali vse genetske informacije, potrebne za proizvodnjo virusnega vektorja.
• Procesna analitska tehnologija (PAT): Senzorji in analitska orodja, ki omogočajo spremljanje proizvodnega procesa med njegovim potekom. PAT lahko pomaga prepoznati odstopanja še pred dokončanjem končnega izdelka.
• Biološka učinkovitost (potency): Merilo, ali biološki izdelek opravlja svojo predvideno funkcijo. Serija lahko vsebuje veliko vektorskih delcev, vendar njihovo število samo po sebi še ne dokazuje, da lahko učinkovito dostavijo genetski material.
• Dobra proizvodna praksa (GMP): Sistem nadzorovanih proizvodnih zahtev, namenjen zagotavljanju dosledne in varne proizvodnje zdravil ter ustrezne dokumentacije in sledljivosti.

Od biološkega dostavnega sistema do proizvedenega zdravila

Virusi so skozi evolucijo razvili mehanizme za vstopanje v celice in prenos genetskega materiala. Raziskovalci na področju genske terapije te mehanizme prilagajajo za dostavo terapevtskih genetskih navodil. Glede na uporabo lahko virusni vektor prenaša delujočo kopijo gena, navodila za proizvodnjo terapevtske beljakovine ali genetske informacije, ki imunski celici omogočijo prepoznavanje nove tarče.

V raziskavah in kliničnem razvoju se uporablja več vrst virusnih vektorjev, med drugim lentivirusni, retrovirusni, adenovirusni in z adenovirusi povezani virusni vektorji (AAV). Vsaka vrsta ima drugačne biološke in proizvodne značilnosti, zato noben vektor ni primeren za vse vrste uporabe. Na izbiro vplivajo količina genetskega materiala, ki ga lahko prenaša, vrste celic, ki jih lahko doseže, trajanje izražanja gena, varnostni profil in razpoložljivo proizvodno znanje.

Pri celičnih terapijah ex vivo se lahko virusni vektorji uporabljajo za gensko spreminjanje imunskih celic. Celice odvzamemo, jih zunaj telesa spremenimo, namnožimo, testiramo in nato apliciramo bolniku. Na tem načelu temeljijo terapije, pri katerih limfocite T opremimo z receptorji, ki jim pomagajo prepoznavati obolele celice. Predavanje je obravnavalo terapije CAR-T in pristope, ki temeljijo na receptorjih limfocitov T (TCR), vključno z njihovim potencialom pri zdravljenju solidnih tumorjev. Če želite izvedeti več o terapiji CAR-T, priporočamo članek dr. Tine Fink Živa zdravila: obeti in izzivi terapije CAR-T, ki je del naše zbirke prispevkov s poletne delavnice CTGCT.

Raziskovalci preučujejo tudi lipidne nanodelce, elektroporacijo in druge nevirusne dostavne sisteme. Različne tehnologije dostave imajo različne omejitve glede velikosti tovora, usmerjanja v ciljne celice, trajnosti učinka, varnosti in zahtevnosti proizvodnje. Najprimernejša tehnologija je zato odvisna od terapevtskega cilja.

 

Virusni vektorji so lahko zelo učinkoviti, vendar so biološko kompleksni in zahtevni za proizvodnjo. Njihove kakovosti ni mogoče določiti z vizualnim pregledom. Proizvajalci potrebujejo več analitskih testov, s katerimi preverijo, ali ima posamezna proizvodna serija ustrezno identiteto, čistost, količino in biološko aktivnost.

To nas pripelje do enega osrednjih spoznanj biološke proizvodnje: proizvodni proces je tesno povezan s samim izdelkom. Običajno kemijsko spojino lahko v veliki meri opišemo z njeno molekulsko strukturo. Virusni vektor ali izdelek na osnovi celic pa je bistveno bolj odvisen od živega sistema, surovin, okoljskih pogojev in zaporedja proizvodnih korakov. Če se proces spremeni, se lahko spremenijo tudi lastnosti izdelka.

Proizvodnja se običajno začne z majhno vialo zamrznjenih celic iz celične banke. Celice odmrznejo in jih postopoma razmnožujejo v vedno večjih gojitvenih sistemih. Neposreden prenos iz majhne viale v veliko proizvodno posodo ne bi zagotovil ustrezne začetne gostote celic, zato je pred inokulacijo proizvodnega bioreaktorja potrebnih več stopenj namnoževanja.

Izbira med adherentnimi in suspenzijskimi celicami vpliva na celoten proces. Adherentne celice potrebujejo površine, kot so gojitvene posode, nosilci ali strukture s fiksnim ležiščem. To lahko poveča obseg ročnega dela in oteži povečanje proizvodnega obsega. Suspenzijske celice je pogosto mogoče gojiti v mešanih bioreaktorjih in njihovo proizvodnjo lažje povečati na večje prostornine. Metoda, ki je priročna v zgodnjih raziskavah, lahko zato postane delovno intenzivna in draga, ko mora proizvodnja podpirati klinične raziskave ali zdravljenje večjega števila bolnikov.

Proizvodnja vektorjev pogosto vključuje vnos več plazmidov v proizvodne celice. Vsak plazmid lahko zagotavlja drugo komponento, na primer terapevtsko genetsko zaporedje, strukturne beljakovine ali ovojnico vektorja. Proizvajalci morajo določiti ustrezna razmerja in količine plazmidov, čas vnosa, gostoto celic ter pogoje gojenja. Vsaka dodatna vhodna komponenta pomeni nov vir variabilnosti, ki ga je treba razumeti in nadzorovati.

Stabilne pakirne ali proizvodne celične linije bi lahko poenostavile proizvodnjo, saj bi bili nekateri ali vsi potrebni genetski elementi že vnaprej vključeni v celice. To bi lahko zmanjšalo stroške materiala in variabilnost procesa. Vendar razvoj, karakterizacija, licenciranje in regulativna obravnava takšnih celičnih linij prinašajo svoje izzive.

Ko je proizvodnja končana, se začnejo postopki pridobivanja in čiščenja. Pridobljeni material poleg želenega vektorja vsebuje tudi celice, celične ostanke, beljakovine, nukleinske kisline, sestavine gojitvenega medija in druge nečistoče. Z zaporedjem postopkov odstranijo neželene snovi, izolirajo in koncentrirajo vektor ter ga pripravijo za shranjevanje ali klinično uporabo.

Vsak korak čiščenja lahko izboljša čistost izdelka, vendar lahko hkrati povzroči izgubo produkta ali zmanjša njegovo biološko aktivnost. Dodajanje novih stopenj zato ni samodejno koristno. Razvijalci procesov morajo presoditi, kateri postopki so nujni in katere je mogoče odstraniti, ne da bi ogrozili zahteve glede kakovosti in varnosti. Krajši proces lahko izboljša izkoristek, zmanjša stroške, skrajša proizvodnjo in olajša prenos procesa na drugo proizvodno lokacijo.

Obvladovanje variabilnosti z inženirstvom, avtomatizacijo in podatki

Žive celice so občutljive na svoje okolje. Že majhne razlike v temperaturi, pH, kisiku, hranilih, vzorčenju ali surovinah lahko vplivajo na njihovo rast in na produkt, ki ga proizvajajo. Proizvodni procesi morajo biti zato natančno opredeljeni, da zagotavljajo dosledne rezultate med različnimi serijami, operaterji, napravami in proizvodnimi lokacijami.

Jort je to ponazoril s primerom preiskave dveh proizvodnih obratov, ki sta uporabljala različni metodi odvzema vzorcev za merjenje pH. V enem so uporabljali brizgo, ki je omejevala stik vzorca z zrakom, v drugem pa vrečko za vzorčenje, iz katere je lahko uhajal ogljikov dioksid. Nastala razlika v pH je bila majhna, vendar je vplivala na nadzor procesa in enega od kakovostnih parametrov končnega izdelka. Ugotavljanje vzroka je trajalo več mesecev.

V drugem primeru so potencialni proizvodni proces za cepivo prenesli iz laboratorijskih gojitvenih posod v bioreaktor. Spremembo pH, ki so jo prej ocenjevali z indikatorskim papirjem, so nato izvedli v bioreaktorju z bistveno natančnejšim nadzorom pH. Posledično so celice hitro izgubile sposobnost preživetja. Neprekinjeno spremljanje je razkrilo vzrok in pomagalo razlikovati med neskladjem pri merjenju pH ter morebitno kontaminacijo. Primer kaže, da analitskih metod iz raziskovalne faze ni vedno mogoče neposredno prenesti v nadzorovano proizvodno okolje. Zato je pomembno, da procese že v zgodnjih fazah razvoja oblikujemo v pogojih, ki čim bolj ustrezajo dejanski proizvodnji.

Tudi surovine se lahko razlikujejo med posameznimi proizvodnimi serijami. Jort je opisal, kako je variabilnost ene od sestavin gojitvenega medija vplivala na proizvodnjo v velikem obsegu. Raziskovalci so nato uporabili model bioreaktorja v manjšem merilu, da so nove serije materiala preverili še pred njihovo uporabo v komercialni proizvodnji.

Ti primeri kažejo, da ponovljivost zahteva več kot zgolj splošen protokol. Proizvajalci morajo opredeliti kritične spremenljivke, določiti načine njihovega merjenja in vzpostaviti sprejemljive razpone delovanja. Neuspehi lahko pomenijo izgubo več tednov dela, dragih materialov in dragocenih proizvodnih zmogljivosti. Pri bolnikih, ki čakajo na individualizirane terapije, pa lahko povzročijo tudi zamudo pri zdravljenju.

Razvoj proizvodnih procesov zato temelji na skrbno načrtovanih poskusih. Miniaturni bioreaktorji raziskovalcem omogočajo primerjavo različnih pogojev, kot so temperatura, pH, koncentracija kisika in gostota celic, ob bistveno manjši porabi materiala kot pri proizvodnji v polnem obsegu. Avtomatizirano ravnanje z materiali lahko dodatno izboljša doslednost. Vendar morajo modeli manjšega obsega ustrezno posnemati ključne značilnosti proizvodnje v polnem obsegu, da njihovi rezultati ostanejo uporabni.

 

Spletni senzorji in slikovni sistemi lahko zagotavljajo neprekinjene informacije o celicah in procesnih pogojih brez potrebe po pogostem ročnem vzorčenju. V kombinaciji s strojnim učenjem lahko ta orodja pomagajo ocenjevati število celic, preverjati njihovo sposobnost preživetja in zgodneje zaznavati težave. Če podatki kažejo, da določena serija verjetno ne bo izpolnjevala zahtev glede kakovosti, lahko operaterji pravočasno ukrepajo ali ustavijo proizvodnjo, preden se porabi še več virov.

Podatkovno vodeni modeli lahko usmerjajo tudi načrtovanje poskusov, saj pomagajo prepoznati pogoje, katerih preverjanje bi prineslo največ koristnih informacij. Vendar avtomatizacija in umetna inteligenca ne moreta nadomestiti biološkega in inženirskega strokovnega znanja. Njuna vrednost je predvsem v tem, da interdisciplinarnim ekipam pomagata bolje načrtovati poskuse, hitreje prepoznavati odstopanja in učinkoviteje uporabljati omejene vire.

Proizvodne odločitve določajo cenovno dostopnost in razpoložljivost terapij

Razvoj proizvodnega procesa ni zgolj tehnična naloga. Zgodnje odločitve o celičnih linijah, materialih, opremi, analitskih testih in intelektualni lastnini lahko odločilno vplivajo na to, ali bo terapija cenovno dostopna in komercialno izvedljiva. Nekatere odločitve je po začetku kliničnega razvoja težko spremeniti. Spremenjen proizvodni proces lahko namreč privede do izdelka, ki ni več dovolj primerljiv z različico, prvotno preizkušeno v kliničnih raziskavah. Razvijalci morajo v takem primeru morda izvesti dodatne analitske ali klinične študije, kar povečuje stroške in podaljšuje čas do dostopnosti terapije za bolnike.

Eden od primerov je licenciranje celičnih linij. Celična linija, primerna za laboratorijske raziskave, morda nima ustrezne licence ali ni dovolj dobro karakterizirana za klinično proizvodnjo. Komercialno dostopna proizvodna celična linija lahko zahteva začetna licenčna plačila, letne pristojbine, omejitve pri spreminjanju ali licenčnine ob prihodu terapije na trg. Takšni pogoji so za veliko farmacevtsko podjetje lahko obvladljivi, za univerzo, bolnišnico ali manjše biotehnološko podjetje pa lahko predstavljajo veliko oviro.

Tudi plazmidi in drugi materiali kakovosti GMP so lahko dragi. Zmanjšanje števila plazmidov, razvoj stabilnih proizvodnih celic ali izboljšanje izkoristka proizvodnje vektorjev lahko znižajo stroške. Vendar tehnično najproduktivnejši sistem ni vedno tudi najboljša celostna rešitev, če ga spremljajo omejujoči pogoji intelektualne lastnine, zahtevne regulativne obveznosti ali odvisnost od enega samega dobavitelja.

Proizvajalci morajo izbrati tudi ustrezen način obratovanja. Pri šaržnem procesu se proizvodnja začne z določeno količino materiala, produkt pa se pridobi po vnaprej določenem času. Pri procesu z dohranjevanjem (fed-batch) se med gojenjem dodajajo hranila, medtem ko perfuzijski sistemi zadržujejo celice in neprekinjeno nadomeščajo izrabljeni gojitveni medij. Perfuzija lahko poveča produktivnost pri omejeni prostornini bioreaktorja, vendar zahteva dodatno opremo, nadzorne sisteme in prinaša večjo regulativno kompleksnost.

Produktivnejši in kompaktnejši sistemi bi lahko podprli regionalno ali decentralizirano proizvodnjo. Manjši proizvodni obrati so lahko posebej koristni, kadar je izdelek nestabilen, zahteva izjemno hladno transportno verigo ali mora hitro prispeti do bolnika. Porazdeljena proizvodnja bi lahko povečala tudi odpornost oskrbovalnega sistema, saj bi zmanjšala odvisnost od ene same proizvodne lokacije. Vendar bi morala vsaka lokacija dokazati, da lahko proizvaja primerljiv izdelek.

Čas je posebej pomemben pri bolniku prilagojenih celičnih terapijah, pri katerih je treba celice odvzeti, transportirati, spremeniti, testirati in vrniti bolniku. Zaprte in avtomatizirane proizvodne platforme bi lahko skrajšale ta postopek, zmanjšale tveganje za kontaminacijo in omogočile proizvodnjo bližje bolnišnicam, ne da bi pri tem ogrozile varnost ali kakovost.

Vendar lahko tudi učinkovita terapija ostane nedostopna, če je njena proizvodnja predraga ali prezahtevna za povečanje obsega. Cenovno dostopnost morajo zato že zgodaj upoštevati raziskovalci, regulatorji, proizvajalci, vlagatelji in izvajalci zdravstvenih storitev.

Prenos terapije v klinično uporabo zahteva tudi sodelovanje biologov, inženirjev, zdravnikov, analitskih znanstvenikov ter strokovnjakov za regulativo in finance. Vsaka stroka prinaša drugačne prednostne naloge, od biološke učinkovitosti in varnosti do možnosti povečanja proizvodnje, licenciranja in stroškov. Cilj ni optimizirati le ene spremenljivke, temveč uskladiti vse te zahteve in razviti terapije, ki bodo varne, učinkovite in dostopne.

 

Zaključek

Virusni vektorji predstavljajo pomembno povezavo med genetskim znanjem in terapevtsko uporabo. Omogočajo dostavo novih genetskih navodil neposredno v telo ali spreminjanje celic zunaj bolnikovega telesa, preden jih uporabimo za zdravljenje. Njihov potencial pa je odvisen od sposobnosti varne, dosledne in stroškovno ustrezne proizvodnje.

Za dosego tega cilja ni dovolj zgolj povečati števila proizvedenih vektorskih delcev. Razvijalci morajo izbrati primerne celice in materiale, nadzorovati pogoje gojenja, očistiti vektor brez poškodb, vzpostaviti smiselne analitske teste in razumeti, kako majhne spremembe procesa vplivajo na kakovost. Avtomatizacija, miniaturni bioreaktorji, senzorji za neprekinjeno spremljanje in podatkovno vodeni modeli lahko to delo pospešijo, vendar morajo temeljiti na dobrem razumevanju biologije in skrbno načrtovanih poskusih.

Proizvodna strategija bo na koncu vplivala na to, katere terapije bodo dosegle bolnike in komu bodo dostopne. Znanstveno obetavno zdravljenje lahko ostane omejeno na laboratorij, če je njegov proizvodni proces nezanesljiv, če so materiali predragi ali če pogoji intelektualne lastnine odvračajo nadaljnje naložbe. Načrtovanje proizvodnje z upoštevanjem možnosti povečanja obsega, cenovne dostopnosti in skladnosti z regulativnimi zahtevami že od samega začetka je zato sestavni del inovacij pri razvoju terapij.

Ekipa CTGCT se ob koncu zahvaljuje Jortu Altenburgu za praktično in celovito predstavitev proizvodnje virusnih vektorjev ter za nazoren prikaz, kako procesno inženirstvo povezuje laboratorijske raziskave s prenosom v klinično uporabo, industrijsko proizvodnjo in dostopnostjo terapij za bolnike.